نتایج کاشت حلزون مرتبط با نوع تشخیص ژنتیکی کم شنوایی

نتایج کاشت حلزون با نوع تشخیص ژنتیکی کم شنوایی دوران کودکی مرتبط است

13 ژانویه 2023 |

تحقیقات جدید نشان می‌دهد که در کم‌شنوایی دوران کودکی، استفاده از تشخیص ژنتیکی ممکن است به شناسایی ژن‌ها و واریانت­های خاصی منجر شود که خود سرنخ‌هایی را، از علائم و مسیر کم‌شنوایی فرد گرفته تا پیامدهای کاشت حلزون، ارائه می­دهند. بر اساس نتایج مقاله­ای که اخیراً در نشریه JAMA Otolaryngology-Head and Neck Surgery به چاپ رسیده، استفاده از تشخیص‌های ژنتیکی، اطلاعاتی در مورد پیشرفت کم‌شنوایی و پیامدهای احتمالی سندرمی آن فراهم کرده و زمان‌بندی بهینه‌تر جهت درمان را ممکن می‌سازد. لذا انجـام آزمایش ژنتیکی جامع روی کودکان مبتلابه کم‌شنوایی حسی عصبی، نه تنها آموزنده، بلکه از نظر پزشکی ضروری است و باید در صورت امکان در مراقبت‌های استاندارد گنجانده شود. در طی این پژوهش، محققان با استفاده از روش توالی‌یابی هدفمند جذب ترکیبی[1] که یک روش هدفمند توالی‌یابی نسل جدید (NGS) است که از پروب­های الیگونوکلئوتیدی طولانی و بیوتینیله شده برای هیبرید شدن در مناطق مورد نظر استفاده می‌کند، بررسی­هایی را روی 191 ژن با ارتباط شناخته شده یا مشکوک به کم‌شنوایی انجام داده­اند. نتایج نشـان داد که از میان 449 کودک از 406 خانواده که قبل از 18 سالگی تحت درمان برای کم‌شنوایی حسی عصبی دوطرفه[2] (SNHL) قرار داشتند، برای بیش از نیمی از خانواده‌ها و 67 درصد از خانواده‌های دارای بیش از یک فرزند مبتلا به  SNHL یک ناهنجاری ژنتیکی تشخیص داده‌شد. سپس اعضای این تیم داده‌های تشخیصی ژنتیکی را در کنار داده­های حاصل از اندازه‌گیری‌های شنوایی‌سنجی گذشته‌نگر و نیز اطلاعات درک­ گفتار جمع‌آوری شده طی دو تا 16 سال پس از کاشت حلزون در افراد را مورد تجزیه و تحلیل قرار دادند. به گفته پژوهشگران: «با توجه به وجود یک ناهمگونی ژنتیکی در کم‌شنوایی دوران کودکی، ممکن است تنوع در نتایج کاشت حلزون را نیز تا حدی به ژن مسئول کاهش شنوایی مربوط دانست. در همین راستا، ما تشخیص ژنتیکی کم‌شنوایی را برای گروهی از کودکان مبتلا به کم‌شنوایی حسی عصبی دو طرفه انجام دادیم تا پروفایل‌های شنوایی سنجی را بر اساس سن و ژنوتیپ مشخص کنیم و در نهایت موفقیت کاشت حلزون شنوایی را بر اساس تست‌های ادراک گفتار بالینی ارزیابی کنیم.”

نتایج این بررسی­ها بیانگر این موضوع بود که همه کودکان به جز یک نفر، تنها در یک ژن، دارای واریانت آسیب­رسـان[3] بودند. به طور کلی، شناسایی ژن یا واریته‌ی ژنی که عامل ناشنوایی است می‌تواند سرنخ‌های زیادی را از شدت علائم گرفته تا الگوهای پیشرفت کم‌شنوایی ارائه ‌دهد. برای مثال، کودکانی که دارای جهش‌های کوتاه کننده[4] در ژن GJB2 بودند، دچار کاهش شنوایی شدیدتر از مواردی بودند که به‌عنوان ‌مثال، جهش‌های missense در همان ژن داشتند. شدت کم‌شنوایی همچنین بر اساس ژن دخیل متفاوت است؛ به عنوان مثال نارسایی در ژنی مانند SOX10 نوع شدیدی از کم‌شنوایی را سبب می­شود در حالیکه نارسایی در برخی دیگر از ژن‌ها یا منجر به اشکال خفیف تا متوسطSNHL  و یا کاهش شنوایی در یکسری از فرکانس‌های صوتی خاص می‌شوند.

به همین ترتیب، محققان شاهد بهبود درک گفتار در تمام کودکانی بودند که کاشت حلزون بر روی آنان انجـام گرفته، هرچند میزان بهبودی، با علت کاهش شنوایی شناسایی شده مرتبط بوده است. به طور خاص، آن‌ها شاهد بهبود قابل توجه ادراک گفتار در کودکان مبتلا به کم‌شنوایی مرتبط با جهش MITF یا TMPRSS3 بودند. در واقع، آزمایش ادراک گفتار نشان داد که ایمپلنت برای همه بیماران مبتلا به کم‌شنوایی مرتبط با TMPRSS3 موفقیت‌آمیز بوده و در میان بالاترین امتیازات ادراک گفتار پس از کاشت برای بیماران ژنوتیپ­های گوناگون قرار دارد.

این یافته‌ها نشان می‌دهد که برای کسب بهترین عملکرد بالینی، آزمایش ژنتیکی برای شناسایی بیمارانی انجام شودکه ژنوتیپ آن‌ها نشان می‌دهد که ممکن است زودتر از آنچه آزمایش شنوایی سنجی استاندارد آن‌ها نشان می‌دهد، کاندیدهای خوبی برای کاشت حلزون شنوایی باشند.

منبع: www.genomeweb.com

تفاوت بین NGS و Sanger Sequencing

در اصل، مفاهیم بنیادی فن‌آوری‌های Sanger در مقابل توالی‌یابی نسل جدید(NGS) مشابه هستند. در هر دو توالی‌یابی NGS و Sanger (همچنین به عنوان توالی‌یابی دی‌اکسی یا الکتروفورز مویرگی[5] نیز شناخته می‌شود)، DNA پلیمراز نوکلئوتیدهای فلورسنت را یک به یک، به یک رشته الگوی DNA در حال رشد اضافه می‌کند. هر نوکلئوتید ترکیب شده با برچسب فلورسنت خود شناسایی می‌شود. تفاوت اساسی بین توالی یابی Sanger و NGS حجم توالی‌یابی است. در حالی که روش سانگر فقط یک قطعه DNA را در یک زمان توالی­یابی می‌کند، NGS به طور گسترده­ای واکنش‌هایی را به شکل موازی به پیش ­برده و میلیون‌ها قطعه را به طور همزمان در هر اجرا توالی‌یابی می‌کند. این فرآیند به تعیین توالی صدها تا هزاران ژن در یک زمان تبدیل می‌شود. NGS همچنین قدرت کشف بیشتری برای تشخیص واریانت­های جدید یا نادر با بهره­گیری از توالی‌یابی عمیق[6] ارائه می‌دهد.

از جمله مزایای توالی NGS در مقابل Sanger می‌توان به حساسیت بالاتر برای تشخیص واریانت‌هایی با شیوع کم، turnaround time سریعتر برای حجم نمونه بالا، پوشش ژنومی جامع، حد پایین تشخیص، ظرفیت بالاتر برای sample multiplexing، توانایی توالی‌یابی صدها تا هزاران ژن یا ناحیه ژنی به طور همزمان اشاره کرد.

مراحل اصلی توالی یابی نسل جدید جریان کار توالی‌یابی نسل بعدی شامل سه مرحله اساسی است: آماده‌سازی کتابخانه (library preparation)، توالی‌یابی (sequencing) و تجزیه و تحلیل داده‌ها (data analysis).

آماده شدن برای انجام NGS

قبل از شروع به انجام NGS، اسید‌نوکلئیک را جدا و خالص می­کنند. لازم است در نظر داشته باشیم که در برخی از روش‌های استخراج DNA ممکن است از ترکیباتی استفاده شود که  بر واکنش‌های آنزیمی که در جریان کار NGS رخ می‌دهند اثر بازدارندگی داشته باشند. به‌همین دلیل بهتر است برای بدست آوردن نتایج بهتر، از یک پروتکل استخراج بهینه شده برای نمونه خود استفاده کنید. برای آزمایش‌های توالی‌یابی RNA، RNA را با رونویسی معکوس به cDNA تبدیل می­کنند. پس از استخراج، اکثر گردش‌های کاری توالی­یابی­های نسل بعد[7] به یک مرحله QC نیاز دارند. استفاده از اسپکتروفتومتری UV را برای ارزیابی خلوص و روش‌های فلورومتری برای کمی‌سازی اسیدنوکلئیک توصیه شده­اند.

مرحله 1 در گردش کار NGS: آماده‌سازی کتابخانه

آماده سازی کتابخانه برای موفقیت گردش کار NGS بسیار مهم است. این مرحله نمونه های DNA یا RNA را برای سازگاری با یک توالی­سنجی آماده می‌کند. کتابخانه‌های توالی‌یابی معمولاً با قطعه قطعه کردن DNA و افزودن آداپتورهای اختصاصی به هر دو انتها ایجاد می‌شوند. در جریان کار توالی یابی Illumina، این آداپتورها حاوی توالی‌های مکمل هستند که به قطعات DNA اجازه می‌دهند به flow cell متصل شوند. Flow cell در واقع کانالی است برای جذب قطعات DNA متحرک، و همچنین به عنوان مخزن هسته راکتور توالی‌یابی قلمداد می­شود. سپس قطعات را می‌توان تکثیر و خالص کرد. برای صرفه‌جویی در منابع، چندین کتابخانه را می‌توان با هم ادغام کرد و در یک اجرا توالی‌یابی کرد – فرآیندی که به عنوان چندگانه سازی[8] شناخته می‌شود. در طی پروسه adapter ligation، توالی‌های شاخص منحصر به فرد یا “بارکدها” به هر کتابخانه اضافه می‌شود. این بارکدها برای تمایز بین کتابخانه‌ها در طول تجزیه و تحلیل داده‌ها استفاده می‌شوند.

مرحله 2 در گردش کار NGS: توالی­یابی یا Sequencing

در طول مرحله توالی‌یابی گردش کار NGS، کتابخانه‌ها بر روی یک flow cell بارگذاری می‌شوند و روی ترتیب دهنده قرار می‌گیرند. خوشه‌های قطعات DNA در فرآیندی به نام تولید خوشه‌ای تقویت می‌شوند که منجر به تولید میلیون‌ها نسخه از DNA تک رشته‌ای می‌شود. در اکثر ابزارهای توالی‌یابی Illumina، خوشه بندی به طور خودکار انجام می‌شود.

در فرآیندی به نام توالی‌یابی با سنتز (sequencing by synthesis)، نوکلئوتیدهای اصلاح شده شیمیایی از طریق مکمل طبیعی به رشته الگوی DNA متصل می‌شوند. هر نوکلئوتید حاوی یک tag فلورسنت و یک پایان‌دهنده برگشت‌پذیر[9] است که از ادغام باز بعدی جلوگیری می‌کند. سیگنال فلورسنت نشان می‌دهد که کدام نوکلئوتید اضافه شده‌است، و پایان دهنده، شکاف می‌دهد تا باز بعدی بتواند متصل شود. پس از خواندن رشته DNA رو به جلو[10]، توالی­های خوانده شده شسته می‌شوند و این روند برای رشته معکوس تکرار می‌شود. به این روش توالی یابی زوجی[11] می‌گویند.

مرحله 3 در گردش کار NGS: تجزیه و تحلیل داده ها

پس از تعیین توالی، نرم افزار دستگاه با دقت پیش‌بینی شده­ای شروع به شناسایی نوکلئوتیدها (فرآیندی به نام فراخوانی بازها[12]) می‌کند. در طول تجزیه و تحلیل داده‌ها، می‌توانید داده‌های توالی خود را به یک ابزار تجزیه و تحلیل استاندارد وارد کنید یا pipeline خود را راه‌اندازی کنید. امروزه می‌توانید از برنامه‌های تجزیه و تحلیل داده‌های بصری برای تجزیه و تحلیل داده‌های NGS بدون آموزش بیوانفورماتیک یا کارکنان اضافی آزمایشگاه استفاده کنید. این ابزارها sequence alignment، فراخوانی واریانت­ها[13]، تجسم داده[14] یا تفسیر را فراهم می کنند.

منبع: www.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing

[1] hybrid capture sequencing

[2] bilateral sensorineural hearing loss

[3] causal variants

[4] truncating mutations

[5] capillary electrophoresis sequencing

[6] deep sequencing

[7] next-generation sequencing workflow

[8] multiplexing

[9] reversible terminator

[10] forward DNA strand

[11] paired-end sequencing

[12] base calling

[13] variant calling

[14] data visualization